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Protocol de Coloração para Raízes Colonizadas com Micorriza Arbuscular

Protocolo de Coloração para Raízes colonizadas com Micorriza Arbuscular

 MATERIAL VEGETATIVO

Este procedimento deve ser optimizado para ser favorável a determinado tecido radicular que você esta usando, e será afectado pela idade da raíz, condições ambientais de crescimento e condições gerais  e o método de fixacção (se houver) das suas raízes. É central para o sucesso desde processo de coloração que o tecido esteja completamente limpo através da aplicação de KOH antes de aplicação da tinta corante.

Algumas coisas para por em mente:

  • Se começar com raízes armazenadas num fixador, e necessário lavar-las com agua de torneira duas vezes.
  • Raizes velhos or provenientes do campo a tendencia sera de resistir a limpeza, por causa da acumulacao de taninos e outras substancias.

PROCEDIMENTO

1. Poe as raizes em covetes de forma que as amostras cabe os 50% da parte de baixo do recipiente. Os recipientes mais usados sao os vasos de sintilacao ou tubos de ensaio de varios tamanhos. Para alem do tamanho, a unica outra consideracao e de que o recipiente e feito de um material autocleavel.Se estas a trabalhar com muitas amostras, voce querera cobrir os recipientes com uma rede de tecido de forma que as solucoes poreao facilmente serem mudadas. Armaduras abertas (com redes de tecido incluidos) podem ser adquiridas para vasos de sintilacao de 40ml.

2. Adicione 10% KOH (w/v) em cada recipiente, assegurando que a amostra esta completamente coberta e que os fluidos nao esta mais que a metade do recipiente. Para as raizes colhidas do campo, voce deve manter em agua ate o dia seguinte, assegurando-se de substituir com KOH fresco antes do tratamento com calor. Voce vai ver que o KOH muda para amarelo no dia seguinte, indicando que os taninos deixaram o seu tecido e passaram para a solucao. O tratamento feito para o dia seguinte pode ser feito antes ou logo a seguir do tratamento com calor. Em alsguns casos, dois periodos de tratamento com agua serao necessarios. 

3. O tratamento com calor poderá ser fervendo em banho-maria ou atraves de auto-clavgem.Esta e a parte de procedimento que precisa muito de ser optimizado. Para as raizes crescidas na estufa com 2-3 semanas de idade, somente 15 minutos sao necessarios para auto-clavagem (sem primeiro lavar com KOH). Raizes adventicias do milho provinientes do campo, que tem 1cm de diametro e de 2-3 meses de idade, e necessaria a lavagem ate o dia seguinte e mais que uma hora no auto-clave. Tempo de fervura e geramente longo compardo com o tempo gasto no processo de auto-clave.

As raízes bem cozidas parecem grãos de arroz cozido. Elas são ao mesmo tempo translúcidos e transparentes, e são brancos (nem um pouco amarelados!) Lembre-se que limpando com KOH remove muitas substancias na parede celular, portanto, depois dste processo, as raizes sao muido moles e facilmente amolgadas. As raises laterais poderao ser parcial ou completamente desintegradas.   Um cuidado deve ser tomado para nao dissolver partes do tecido de baixo (o cortex, geralmente vai primeiro). E dificil ter a certeza de que as raizes estao completamente lavadas sem aplicar a tinta para a coloracao, mas uma examinacao das raizes limpas e nao pintadas num microscopio de 4x de ampliacao, ira revelar o tecido branco composto de celelas rodeadas de pareded celulares finas e cinzentas. Tambem, voce sera capaz de focalizar na amostra.

4. Remove amostras do auto-clave e lave com agua de torneira tres vezes. Adicione 5% HCl e deixa estar por cerca de um minuto. Retira do HCl e adicine  a tinta azul trypan. Deixa ficar para dia seguinte ( pode ser por mais tempo tambem) e examina as raizes do microscopio disectico.

Se as raízes estao muito tem a cor azul-escuro elas nao ficaram suficientemente limpas no KOH e a optimizacao seguinte sera necessaria.

Tinta: 1 L glicerol

950 ml agua distilada

50 ml acido acetico

0.2 g trypan azul

5. O método típico de quantificação de da colonização das raízes é através de Método de Grade de intersecção (McGonigle et al, 1990). Este método ja foi adaptado muitas vezes e cada investigador deve considerar em optimizar este procedimento de examinação e quantificação para ir ao encontro dos dados a colectar. A baixo estão algumas abordagens possíveis.

 

MÉTODOS de EXAMINAÇAO

1. MICROSCOPIO OPTICO

As raízes podem ser examinadas em pequenos seguimentos posto entre duas placas microscópicas de vidro (slide) ( a versão de método de "abóbora' ) e a quantificação pode ser feita usando tanto área ocular ou com linhas quatripuladas ou micrometro. Existem algumas vantagens com este método. Primeiro, o tecido está sendo examinado sub um microscópio óptico que permite obter uma melhor imagem em relação ao estero-microscópio. Depois, o tecido é facilmente esmagado e espalhado, permitindo a melhor visualização das estructuras do fungo. Uma desvantagem aqui é o aumento do tempo gasto.

2. ESTEREO ('DISSECTING') MICROSCOPIO

Todas as raízes podem ser examinadas usando pratos de Petri que tem uma travessa gradeada de vidro. As Raízes são postas num prato com água e a travessa é posta por cima. O investigador move o prato num movimento para trás e para frente, de forma que todas as intesecções na travessa estejam examinadas. Uma vantagem aqui é de que pode-se examinar um maior número de amostras. A disvantagem é de que poderá ser mais difícil de reconhecer ou identificar estructuras do fundo usando o microscópio estereo.

METODOS DE QUANTIFICAÇAO

A quantificação é feita calculando a percentagem de colonização da sua amostra. Você poderá usar somente duas categorias (' micorrizado e não-micorrizado') ou você pode escolher em sub-dividir em várias categorias de estruturas do fungo (isto é, vesículos, arbúsculos e flagelo). Em qualquer dos casos você precisará de monitorar a contagem dos números. Se estiver a usar duas categorias, você poderá contar com contadores manuais, tendo um contador manuar em cada mão. Se tiver um só contador manual, você poderá contar os números da outra coategoria usando a sua cabeça. A repetição para confirmação, será necessária se tiver mais de duas categorias.